Сбор фитобентоса. Для изучения видового состава фитобентоса на поверхности водоема достаточно извлечь некоторое количество донного грунта и отложений на нем. На мелководьях (до 0,5 – 1,0 м глубины) это достигается с помощью опущенной на дно пробирки или сифона – резинового шланга со стеклянными трубками на концах, в который засасывают наилок. На глубинах качественные пробы отбирают с помощью ведерка или стакана, прикрепленного к палке, а также различными грабельками, «кошками», драгами, дночерпателями, илососами и т.п.
Сбор перифитона. С целью изучения видового состава перифитона налет на поверхности разнообразных подводных предметов (галька, щебень, камни, стебли и листья высших растений, раковины моллюсков, деревянные и бетонированные части гидротехнических сооружений и др.) снимают с помощью обычного ножа или специальных скребков. Однако при этом гибнут многие интересные организмы; часть их уносится токами воды, разрушаются органы прикрепления водорослей к субстрату, нарушается картина взаимного размещения компонентов биоценоза. Поэтому водоросли лучше собирать вместе с субстратом, который полностью или частично осторожно извлекают на поверхность воды так, чтобы течение не смыло с него водоросли. Извлеченный субстрат (или его фрагмент) вместе с водорослями помещают в приготовленный для пробы сосуд и заливают лишь небольшим количеством воды из этого же водоема с целью дальнейшего изучения собранного материала в живом состоянии либо 4%-м раствором формальдегида.
Наземные, или воздушные водоросли собирают по возможности вместе с субстратом в стерильные бумажные пакеты или в стеклянные сосуды с 4%-м раствором формальдегида.
Методы сбора и изучения почвенных водорослей подробно изложены в специальной литературе (Голлербах, Штина, 1969).
Этикетирование и фиксация проб. Ведение полевого дневника.
Для изучения водорослей в живом и фиксированном состоянии собранный материал делят на две части. Живой материал помещают в стерильные стеклянные сосуды (пробирки, колбы, баночки), закрытые ватными пробками, причем не заполняя их доверху, или в стерильные бумажные пакеты. Чтобы лучше сохранить водоросли в живом состоянии в экспедиционных условиях, водные пробы упаковывают во влажную оберточную бумагу и помещают в ящики. Пробы должны периодически распаковываться и выставляться на рассеянный свет для поддержания фотосинтетических процессов и обогащения среды кислородом.
Материал, подлежащий фиксации, помещают в чисто вымытую и высушенную стеклянную посуду (пробирки, бутылки, баночки), плотно закрытую корковыми или резиновыми пробками. Водные пробы фиксируют 40%-м формальдегидом, приливая его в количестве 0,1 от объема собранной пробы. Водоросли, находящиеся на твердом субстрате (бумажные фильтры, галька, пустые раковины моллюсков и т.д.), заливают 4%-м раствором формальдегида. Хорошую сохранность водорослей и их окраски обеспечивает также раствор формальдегида и хромовых квасцов (5 мл 4%-го формальдегида и 10 г K
2
4
2
4
3
2
Собранные пробы тщательно этикетируют. На этикетках, заполняемых простым карандашом, указывают номер пробы, время и место сбора, орудие сбора и фамилию сборщика. Эти же данные фиксируют и в полевом дневнике, в который, кроме того, заносят результаты измерений pH, температуры воды и воздуха, схематический рисунок, подробное описание исследуемого водоема, развивающейся в нем высшей водной растительности и другие наблюдения.
Качественное изучение собранного материала. Материал предварительно просматривают под микроскопом в живом состоянии в день сбора, чтобы отметить качественное состояние водорослей до наступления изменений, вызванных хранением живого материала или фиксацией проб (образование репродуктивных клеток, колоний, потеря жгутиков и подвижности и т.д.). В дальнейшем его изучают параллельно в живом и фиксированном состоянии.
Работа с живым материалом является необходимым условием успешного изучения преобладающего большинства водорослей, изменяющих форму тела, форму и окраску хроматофоров, теряющих жгутики, подвижность или даже полностью разрушающихся при фиксации. Чтобы сохранить собранный материал живым, его следует оберегать от перегрева, загрязнения фиксаторами, а изучение проводить как можно быстрее.
Водоросли в живом состоянии в зависимости от размеров и других особенностей изучают с помощью бинокулярной стереоскопической лупы (МБС-1) или световых микроскопов.
Для микроскопического изучения водорослей готовят препараты: на предметное стекло наносят каплю исследуемой жидкости и накрывают ее покровным стеклом. Если водоросли обитают вне воды, их помещают в каплю водопроводной воды или оводненного глицерина. Следует помнить, что при длительном изучении препарата жидкость под покровным стеклом постепенно высыхает и время от времени ее необходимо добавлять. Для уменьшения испарения по краям покровного стекла наносят тонкий слой парафина или лак для ногтей.
При необходимости длительных наблюдений над одним и тем же объектом хороший результат дает метод висячей кати. На чистое покровное стекло наносят маленькую каплю исследуемой жидкости, после чего покровное стекло, края которого покрыты парафином, парафиновым маслом или вазелином, накладывают каплей вниз на специальное предметное стекло с лункой посередине так, чтобы капля не касалась дна лунки. Такой препарат можно изучать в течение нескольких месяцев, сохраняя его в перерывах между работой во влажной камере.
При изучении водорослей, имеющих монадную структуру, серьезной помехой служит их подвижность. Однако при подсыхании препарата движение постепенно замедляется и приостанавливается. Замедлению движения способствует также осторожное нагревание препарата или добавление вишневого клея. Подвижные водоросли рекомендуется фиксировать парами оксида осмия (при этом хорошо сохраняются жгутики), кристаллического иода (фиксация парами иода позволяет не только сохранить жгутики, но и окрасить крахмал, если он есть, в синий цвет, что имеет диагностическое значение), 4%-го формальдегида, слабым раствором хлоралгидрата или хлороформа. Длительность экспозиции над парами фиксаторов устанавливают экспериментально, в зависимости от специфики объекта. Наиболее удобны для изучения слабофиксированные препараты, в которых часть водорослей потеряла подвижность, а другие продолжают медленно двигаться. Препараты следует изучать немедленно после фиксации, так как в течение короткого периода времени водоросли деформируются.
При изучении внутриклеточных структур, особенно у мелких жгутиковых, применяют окрашивание с помощью слабых растворов (0,005 – 0,0001%) нейтрального красного, метиленового голубого, нейтрального голубого, трипанового красного, бриллиант-крезилового синего, конго красного, зелени Януса, позволяющих более четко выявить клеточную оболочку, папиллы, слизь, вакуоли, митохондрии, аппарат Гольджи и другие органеллы.
Многие красители дают хороший результат лишь после применения специальных методов фиксации (при изучении фиксированных формальдегидом проб успешное применение красителей возможно только после тщательного отмывания исследуемого материала дистиллированной водой). Самый лучший фиксатор для цитологического исследования водорослей, в том числе изучения их ультраструктуры, – 1 – 2%-й раствор оксида осмия (раствор не подлежит длительному хранению). Водоросли, не имеющие настоящих клеточных оболочек, хорошо и быстро фиксируются метанолом. Раствор Люголя (1 г йодида калия и 1 г кристаллического йода в 100 мл воды) не только хорошо фиксирует водоросли, но и одновременно окрашивает крахмал в синий цвет.